Peralatan dan Bahan untuk Membuat Kultur Murni

Tempat kerja berupa ruangan tertutup dengan aliran udara yang diatur menggunakan filter khusus dan dilengkapi lampu ultraviolet dibutuhkan dalam pembuatan kultur murni. Sebelum digunakan, lampu ultraviolet dinyalakan untuk mensterilkan ruang tersebut. Tempat menanam kultur murni dapat berupa peralatan yang disebut laminar air flow atau yang lebih sederhana berupa enkas.

Laminar air flow, tempat menanam kultur murni.

Laminar air flow, tempat menanam kultur murni.

Laminar air flow dilengkapi dengan filter khusus yang berfungsi untuk menyaring udara sehingga udara yang masuk ruang menjadi steril. Sementara enkas hanya berupa kotak kayu yang diberi kaca dengan beberapa lubang dan diberi sarung tangan untuk memasukkan tangan saat bekerja. Seperti halnya laminar air flow, enkas juga dilengkapi dengan lampu ultraviolet untuk mensterilkan ruangan di dalamnya. Prinsip dari kedua alat ini adalah untuk mengurangi kontak dengan udara luar yang banyak mengandung mikroba.

Untuk mendapatkan hasil kultur murni yang baik dan tidak terkontaminasi adalah dengan mempersiapkan peralatan dan bahan baku yang selalu dalam kondisi steril.

a. Peralatan

Berikut ini beberapa peralatan yang digunakan dalam pembuatan kultur murni.

1) Autoklaf

Autoklaf, alat sterilisasi yang memanfaatkan uap panas bertekanan tinggi.

Autoklaf, alat sterilisasi yang memanfaatkan uap panas bertekanan tinggi.

Autoklaf adalah alat sterilisasi yang memanfaatkan uap air panas bertekanan tinggi dan biasanya digunakan untuk mensterilisasi peralatan atau bahan kultur yang tahan panas dan tidak rusak oleh panas. Pengaturan tekanan pada autoklaf ada yang otomatis dan manual dengan mengatur pemanasnya yang bisa bersumber dari listrik maupun pemanas kompor gas. Sterilisasi menggunakan autoklaf merupakan cara yang paling baik karena uap air panas dengan tekanan tinggi menyebabkan penetrasi uap air ke dalam sel-sel mikroba menjadi optimal sehingga langsung mematikan mikroba.

Cara mengoperasikan autoklaf:

  • Isi tempat air dengan air sampai dekat angsang (dasar tempat untuk meletakkan alat-alat yang akan disterilkan) di dalam bejana.
  • Bungkus terlebih dahulu peralatan ataupun bahan kultur yang akan disterilkan menggunakan kertas sampul cokelat atau alumunium foil, lalu masukan ke dalam bejana tersebut.
  • Pasang tutup dan kencangkan sekrup penutup, lalu buka kran pengatur tempat keluar uap air.
  • Hidupkan pemanas dan biarkan hingga cukup banyak uap air yang keluar melalui kran pengatur uap. Selanjutnya, tutup kran pengatur uap air sehingga tekanan uap di dalam autoklaf meningkat.
  • Lihat manometer dan termometer hingga menunjuk tekanan 2 atm dengan suhu 121⁰C.
  • Pertahankan suhu dan tekanan tersebut selama 30 menit (untuk peralatan) atau 15-20 menit (untuk bahan kultur). Namun, waktu sterilisasi ini tergantung dari peralatan atau bahan yang disterilkan.
  • Bila autoklaf yang digunakan tidak otomatis maka untuk mempertahankan suhu dan tekanan tertentu harus menggunakan tombol pengatur pemanasan.
  • Setelah waktu sterilisasi selesai, jangan langsung membuka penutup autoklaf, tetapi matikan terlebih dahulu pemanasnya dan biarkan hingga dingin atau tekanan pada manometer dan termometer turun sampai ke angka nol, kemudian boleh dibuka. Pembukaan pada tekanan tinggi selain alat gelas pecah dan media dapat tumpah, juga berbahaya karena uap panas langsung menyembur keluar dengan keras dan dapat terjadi ledakan.
  • Peralatan dan bahan yang telah steril tetap dibiarkan terbungkus untuk kemudian dikeringkan di dalam oven.

2) Dandang steamer

Dandang steamer digunakan untuk mensterilkan media yang tidak terlalu tahan terhadap panas, misalnya media yang mengandung gula. Pertama kali dandang diisi air sampai batas dekat angsang. Masukkan tabung-tabung yang berisi media dan susun rapi di atas angsang agar saat mendidih tidak tumpah. Setelah ditutup, panaskan dandang sampai suhunya 100⁰C selama 30 menit untuk mematikan sel vegetatif mikroba. Selanjutnya, diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam agar mikroba dalam bentuk spora dapat tumbuh menjadi sel vegetatifnya. Lakukan kembali proses pemanasan dan inkubasi dengan cara yang sama.

Dalam kegiatan usaha skala rumah tangga, fungsi autoklaf dapat digantikan dengan menggunakan alat presto atau dandang rebus biasa. Dalam kapasitas yang lebih besar, dandang bisa dimodifikasi menggunakan drum bekas yang menggunakan pemanas dari kayu bakar. Namun, sterilisasi menggunakan dandang memakan waktu lebih lama dari autoklaf. Biasanya, dibutuhkan waktu satu jam untuk menaikkan ke suhu 100⁰C (suhu air mendidih) dan hal ini dilakukan sebanyak tiga kali dengan selang waktu satu hari. Proses pendiaman selama satu hari untuk memberi kesempatan spora berkecambah menjadi bentuk vegetatifnya. Bentuk sel vegetatif akan mati apabila terkena panas tinggi.

3) Oven

Selain untuk mengeringkan, oven juga dapat digunakan untuk sterilisasi, yaitu dengan prinsip menggunakan aliran udara panas dan kering. Alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, atau pipet dapat disterilkan dengan alat ini. Bahan lain seperti kapas, kertas, kain saring, juga dapat disterilkan menggunakan oven dalam batasan suhu tertentu. Dalam menggunakan oven harap berhati-hati karena suhu yang terlalu tinggi dalam waktu lama dapat membakar bahan-bahan tersebut. Umumnya, untuk sterilisasi kering oven diatur pada suhu 170-180⁰C selama paling sedikit dua jam. Namun, lama sterilisasi juga tergantung dari ketahanan alat terhadap panas. Oven dapat menggunakan pemanas listrik maupun pemanas gas. Dalam skala rumah tangga, oven yang digunakan biasanya oven yang lebih sederhana, yaitu oven untuk membuat kue.

4) Penimbang dan penakar

Alat timbang berfungsi untuk menimbang bahan-bahan yang akan digunakan dalam pembuatan media kultur. Alat timbang yang baik setidaknya memiliki nilai ketelitian 1/100 g atau dua digit di belakang satuan gram (g). Namun, dalam skala rumah tangga biasanya alat timbang yang digunakan hanya memiliki ketelitian 1-5 g, yaitu alat timbang yang biasa digunakan untuk membuat kue. Bila timbangan kecil tidak ada, bisa menggunakan takaran, yaitu melalui perkiraan.

Sebagai contoh, satu sendok teh penuh diperkirakan berisi 5 g bahan atau satu sendok makan penuh diperkirakan berisi 10 g bahan. Hanya saja, cara ini dianggap tidak terlalu akurat karena ada bahan yang mempunyai bobot tinggi dan ada pula bahan yang berbobot rendah.

Untuk menakar air atau bahan berbentuk cair, alat yang paling tepat untuk digunakan adalah gelas ukur. Saat ini, di pasaran sudah banyak tersedia takaran air berbahan plastik dengan harga yang lebih murah. Takaran air biasa digunakan untuk membuat kue atau untuk mengencerkan susu.

5) Peralatan gelas

Cawan petri, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

Cawan petri, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

 

Pipet, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

Pipet, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

 

Tabung reaksi, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

Tabung reaksi, salah satu alat gelas untuk membuat kultur murni.

Alat gelas ini merupakan alat utama untuk kultur mikroba, sehingga alat ini sebelum digunakan disterilkan terlebih dahulu. Alat gelas ini terdiri atas cawan petri, tabung reaksi dan Erlenmeyer. Pipet digunakan apabila kultur ditanam menggunakan media cair. Untuk alat belas baru, biasanya dibersihkan dengan dicuci menggunakan sabun pencuci piring, dan dibilas air sampai bersih. Untuk membersihkan tabung reaksi biasanya digunakan sikat kecil yang seukuran dengan tabung reaksi.

Apabila tabung atau cawan petri sudah digunakan untuk kultur mikroba maka cara membersihkannya adalah dengan merebus tabung beserta media yang ada di dalamnya sampai media larut dalam air rebusan. Setelah itu, baru tabung dicuci dengan sabun dan dibilas air bersih. Alat gelas yang telah bersih, lalu dikeringkan (bisa menggunakan oven). Tabung atau Erlenmeyer ditutup menggunakan kapas dan dibungkus menggunakan kertas cokelat atau alumunium foil. Setelah itu, semua alat gelas tersebut disterilkan menggunakan autoklaf.

6) Peralatan untuk membuat media

Alat utama pembuat media adalah wadah untuk mencampur media (panci logam atau gelas tahan panas), pengaduk gelas/kayu, alat penyaring dan alat pemanas. Di rumah tangga, pengaduk bisa menggunakan sendok sayur atau pengaduk kayu yang biasa digunakan untuk memasak. Penyaring bisa menggunakan alat penyaring teh atau penyaring santan. Alat pemanas, dapat berupa kompor listrik atau kompor gas. Untuk mengetim media, dapat menggunakan panci biasa yang berukuran lebih besar dari wadah media.

7) Peralatan inokulasi

Lampu spiritus digunakan untuk mensterilkan alat yang digunakan saat pemindahan miselium (inokulasi). Selain itu, agar biakan tidak terkontaminasi dengan mikroba lain maka mulut tabung reaksi didekatkan dengan api dari lampu spiritus. Alat untuk inokulasi umumnya adalah jarum logam bertangkai atau ose yang terbuat dari nikrom atau logam lain. Pekerjaan pemindahan miselium ini dilakukan di dalam ruang steril atau laminar air flow atau enkas.

Jarum inokulasi atau ose sebelum digunakan, disterilkan menggunakan cara pemijaran. Ose dicelupkan dahulu dalam alkohol, lalu dibakar menggunakan api lampu spiritus sampai batang jarum dari ujung sampai pangkal berpijar. Ose tidak bisa langsung digunakan untuk mengambil miselium jamur karena miselium akan mati apabila terkena ose yang masih berpijar. Jadi ose didinginkan terlebih dahulu dengan cara mencelupkan kembali ke dalam alkohol, lalu alkohol dibakar dengan api sebentar baru digunakan untuk mengambil miselium jamur. Pengambilan miselium dengan cara menyentuhkan ujung jarum atau ujung ose pada miselium jamur. Selanjutnya miselium diletakkan pada permukaan media pertumbuhan. Harap diperhatikan saat membuka tabung medium, mulut tabung harus didekatkan dengan api. Setelah ditutup kembali baru dijauhkan dari api.

8) Peralatan inkubasi

Inkubator, digunakan untuk menginkubasi bibit.

Inkubator, digunakan untuk menginkubasi bibit.

Alat utama untuk inkubasi adalah inkubator. Prinsip kerja inkubator hampir sama dengan oven tetapi suhu inkubator dapat diatur pada suhu pertumbuhan mikroba yang bersifat mesofil
(15-55⁰C). Suhu pertumbuhan optimum umumnya sekitar 25⁰C. Sebenarnya suhu ruangan di iklim tropis Indonesia mempunyai suhu rata-rata mendekati suhu optimum sehingga sangat ideal untuk pertumbuhan miselium. Namun, di daerah dengan ketinggian tertentu dan bersuhu terlalu dingin, penggunaan inkubator sangat dianjurkan agar pertumbuhan miselium tidak terhambat. Pada kisaran suhu pertumbuhan, peningkatan suhu dapat mempercepat pertumbuhan tetapi kalau suhu terlalu tinggi akan menghambat pertumbuhan miselium. Dengan inkubator, mikroba dapat ditumbuhkan pada suhu yang diinginkan dengan suhu yang stabil.

Tempat inkubasi bisa menggunakan ruangan biasa, misalnya berupa kayu sederhana yang dibuat bersekat-sekat untuk tempat meletakkan bibit. Dalam skala kecil pembuatan bibit atau untuk keperluan sendiri, tempat inkubasi biasanya sekaligus digunakan sebagai tempat penyimpanan bibit sebar.

9) Peralatan penyimpan kultur murni

Kultur yang telah ditumbuhkan di dalam inkubator, apabila tidak digunakan bisa disimpan di dalam refrigerator atau alat pendingin seperti lemari es (bukan freezer). Pendinginan dimaksudkan untuk memperlambat pertumbuhan sehingga daya simpan kultur menjadi lebih lama. Namun, untuk mencegah pengeringan, kultur yang disimpan di dalam refrigerator atau alat pendingin harus dikemas terlebih dahulu menggunakan kantong-kantong plastik dan ditutup rapat. Bila kultur akan digunakan kembali, harus diinkubasi beberapa saat terlebih gahulu pada tempat dengan suhu ruang.

10) Peralatan lain-lain

Peralatan lain yang dibutuhkan ketika membuat kultur murni di antaranya kapas, kertas sampul cokelat, karet gelang, alumunium foil, kantong plastik, spidol permanen/kertas label, spiritus, korek api, alkohol 70%, dan kertas saring. Kapas untuk menutup tabung reaksi atau Erlenmeyer; kertas sampul cokelat, karet gelang, alumunium foil untuk menutup alat gelas ketika disterilisasi; kantong plastik untuk mengantongi cawan petri apabila diinkubasikan di ruang inkubasi tanpa inkubator; kantong plastik untuk mengemas penyimpanan kultur di dalam refrigerator; spidol permanen/kertas label untuk menulis tanggal pembuatan kultur dan tanggal kedaluarsa; serta spiritus, korek api dan alkohol digunakan saat menanam kultur jamur.

b. Bahan baku membuat kultur murni (bibit penjenis)

Bahan baku utama pembuatan kultur murni bisa berupa media MEA atau media PDA dengan sumber kultur berupa badan buah jamur segar, spora jamur, kultur murni dalam bentuk kering beku (liofilik), atau kultur murni dalam agar miring. Sumber kultur yang sudah teruji keunggulannya bisa didapatkan dari balai penelitian yang meneliti jamur konsumsi seperti Balitsa (Balai Penelitian Sayuran) di bawah Litbang Deptan dan laboratorium-laboratorium perguruan tinggi yang memang melakukan uji coba varietas-varietas unggul jamur konsumsi. Di beberapa daerah juga terdapat UPTD yang sudah mampu menghasilkan bibit induk menggunakan sumber bibit dari balai penelitian. (ss)

 

<< Bab Sebelumnya. Bab Selanjutnya >>

Selengkapnya

Submit a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *